嶋田 透

Following baculovirus infection, the level of host messenger RNA (mRNA) declines and the synthesis of host proteins is shutoff in virus-infected cells. To comprehensively understand the regulation of host gene expression by Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV), we took a complementary DNA (cDNA) subtraction approach. Northern blot analysis was then performed to confirm whether obtained clones are differentially expressed. From these analyses, we obtained 4 down-, 7 up- and 2 non-regulated host gene candidates during the early stage of infection. Sequence analyses showed that these may encode proteins involved in transcription, cell cycle, cell adhesion, protein degradation, apoptosis or energy metabolism. We then measured the ADP/ATP ratio to address the response of host energy metabolism upon baculovirus infection. The ADP/ATP ratio showed cell death-like rapid increase following BmNPV infection with a transient decrease during 12-24 h post-infection (p.i.). Taken together, our results suggest that general events in host cells are controlled at the level of mRNA expression by BmNPV infection.

カイコの休眠卵と非休眠卵のそれぞれで特異的に発現する遺伝子の経時的な探索を行った。多化性品種輪月を長日条件及び短日条件で飼育し、休眠卵・非休眠卵を得た。産卵後12~30時間後の休眠卵および非休眠卵それぞれからRNAを抽出し、逆転写、Cy3/Cy5で蛍光標識したのち、カイコのESTデータベースに登録されている約6000の遺伝子を搭載したcDNAマイクロアレイとハイブリダイゼーションさせた。その結果、2倍以上の発現量の差をもつ遺伝子は数百個、10倍以上の差をもつものも数個検出された。相同性検索によって、その中には呼吸系の酵素や転写制御因子などをコードすると推定される遺伝子が含まれていることが明らかになった。

カイコのゲノム解析を目的にして，全ゲノムショットガンライブラリーを作製した。材料に用いたp50T系統は，東大で25世代以上にわたって一蛾育した近交系である。p50T の後部糸腺から核を単離し，高分子DNAを調製した。 Shearing法により2-3kbのDNA断片とし，pUC118を用いてライブラリーとした。うち9600クローンをforwardプライマーにより配列決定した。得られた配列データをPFPフィルター(Paracel社)に通し，ベクターの配列や既知のカイコ反復配列と100bp以上一致する配列などをマスクした。その過程で，mariner様配列が848リード，BMC1が 481リードなどと，多数の反復配列が検出された。残った8557リードをCAP4 (Paracel社)によりアセンブルした結果，6469リードのシングレットと843のコンティグ（=2088リード）にまとめられた。これらの配列には，まだBMC1が201リード，Bm1が808リードなどと，反復配列が認められたが，いずれも数十から数百bpの短い配列であった。ミトコンドリアDNAに相同な配列が発見されたが，精査の結果mtDNAそのものではなかった。アセンブリーを慎重に行えば，このショットガンライブラリーを用いてカイコの全ゲノム解析を実行できそうである。

これまでにW染色体上にはW-Kabuki, W-KamikazeならびにW-Samuraiと称する3種類のRAPDが得られている。これらのうちW-Kabuki RAPDについては, その配列を含むBACクローンが得られており, そこを起点にcontigが進んでいる。W染色体の解析をさらに進めるためには, 起点となるDNAマーカーを増やす必要がある。そこで本研究では, まず, 新たに合成した500種類の10-merの任意配列プライマーを用い, W染色体上のRAPDの探索を行った。その結果, 1種類のW染色体特異的RAPDが得られた。またW染色体には多くのレトロトランスポゾンが入れ子状態で存在することから, 各種レトロトランスポゾンの配列を含むPCR用プライマーを作製し, 新たなマーカーの探索を行った。その結果, レトロトランスポゾンKabukiとBMC1の配列を含むプライマーの組み合わせにより, 新たなDNAマーカーが得られた。なお, これら2種類のW染色体特異的DNAマーカーは, 限性ゼブラのW染色体上にも存在していたが, 雌決定遺伝子が欠落したW染色体上には存在していなかった。これらのことから, 2種類のDNAマーカーは, 雌決定遺伝子に比較的近い位置に存在するものと考えられた。