竹本 周平

記事種別: 会議・学会報告・シンポジウム

ミズナラをはじめとするナラ属樹木が集団的に枯死するいわゆる“ナラ枯れ”が各地で問題になっている。この森林病害はこれまで日本海側を中心に被害地域を拡大してきたが、最近では内陸部に被害が進展し、平成14年の夏には京都府の内陸部に位置する京都大学フィールドセンター、芦生研究林にまでその被害がおよぶようになった。そこで、この被害実態を調査し、有効な防除法を確立するために研究チームを組織し、調査・研究を開始した。これまでにこのチームが実施した調査・研究は大別して３つの部分からなる。その一つは、被害地における枯死木の発生状況の調査で、第二の課題は感染に対する宿主樹木の応答の動的解析である。これらの課題についてはチームの他のメンバーによって別に発表されるのでここでは省略する。第三の課題は、病原菌を媒介し、被害の流行の原因となっているカシノナガキクイの密度を拮抗菌を用いることににより制御する方法の開発である。この考えは既にメンバーの一員である小林や野崎により、シイタケ菌を用いた防除法として発表されているが、より有効な菌を見いだすためにこの調査・研究が実施された。ここではその結果を紹介する。 抗菌の探索：“ナラ枯れ”の病原菌、Raffaelea quercivora に対し８株の菌類を供試して対峙培養を行い、基質上で示されるR. quercivoraと各供試菌の生長反応を解析し、拮抗力を判定した。用いた菌株はシイタケ、ツキヨタケ、ヒラタケ２株、トリコデルマ４菌株の合計８菌株である。これらの菌をPDA培地上で９日間25℃で前培養後、これら供試菌のいずれか１種とR. quercivora を直径6 mm のディスクとして抜き取り、内径84 mm のシャーレに用意した培地上に互いに 3 cm 隔てて対峙させ、25℃の恒温条件下で生長を観察した。いずれの組み合わせについても繰り返しにはシャーレ１０枚を用いた。 木丸太を用いた拮抗力試験： カシナガが多数穿孔している枯死木を伐倒し、虫の多数潜入している部位を３０ｃｍの長さに切り分け、これを材料とした。接種に先立ち、切断後の丸太の乾燥を防ぐため、両端をパラフィンで封じた。拮抗菌としては、シイタケ、ヒラタケ、トリコデルマ３系統、木材腐朽菌３系統、ボーベリアの合計９ 菌株と、孔をあけただけで、菌を接種しない対照区の合計１０処理区とした。各処理区につき、７反復をとった。したがって、用いた丸太の数は７０本である。接種後、丸太は風通しの良い屋内に放置し、翌年初夏に防虫ネットで被覆し、羽化昆虫を定期的に採取し、カシナガについては雌雄別に、他の昆虫については種類別、あるいはグループ別にカウントした。 野外枯損木への接種試験： 枯損木から周辺健全木への被害の拡大を最小限に抑えるため、拮抗作用があきらかになっているシイタケ菌を枯損木に接種した。用いた菌株はキノックス社のS-10株である。接種に当たっては背負い式ドリルで、地際、胸高、その中間の３つの高さについて穿孔した。孔の間隔は、ガイドネット（幅が30 cm、格子間隔が10 cm のネット）を用い、10 cm間隔で穿孔した。穿孔した孔のうち、十分の一のものに、拮抗菌のタネ駒をできるだけ均等に打ち込んだ。この時、孔の深さは５ｃｍとし、タネ駒は２ｃｍより深くに埋め込んだ。翌年７月初旬より１週間に１度の頻度で２ヶ月間、羽化昆虫をトラップ内から採取し、その数をカウントした。調査・実験の結果は次のようになった。 拮抗菌の探索：供試した８菌株のうち R. quercivora の生長が抑制されるのは、シイタケ菌、ツキヨタケ菌、トリコデルマ・ハルティアーヌム菌、ヒラタケ菌の２株などであったが、トリコデルマの sp.2 やsp. 3 は生長が早く、その効果判定ができなかった。 枯損木丸太を用いた拮抗力試験： 供試した８菌株のうち、菌を接種せず穴だけを空けた対照区より有効であったのはボーベリア菌と、トリコデルマ sp. 2 菌だけであった。 以上のように病原菌を制御したり、カシナガの羽化個体数を制御するために、いくつかの菌類の拮抗力を試験したが、野外における実施結果はまだ出ていない。病原菌やその伝搬者に対して拮抗力を判定するためには、さらに多面的な調査が必要であると総括できよう。

1.目的 ナガキクイムシ科穿孔性昆虫の１種であるカシノナガキクイムシ（Platypus quercivorus）の穿入によってナラ類が大量に枯死する被害が、1980年頃から日本海側を中心に問題になっている。これらの被害木からは例外なく Raffaelea quercivoraが高頻度で分離されている。本研究では本菌の主な宿主木であるミズナラ(Quercus mongolica var. grosseserrata)とコナラ(Quercus serrata)の３年生苗に対してR. quercivoraを接種し、その後本菌の材内進展の様子と、それに伴う材の抽出成分の変化を時間的・空間的に解析することを目的とし、R. quercivoraの再分離と材の抽出成分の定量を行い、その結果を両樹種間で比較した。2. 材料と方法1）Raffaelea quercivoraの接種2003年の７月上旬に、苗の地表から垂直上向きに約10 cmの部位にドリルを用いて直径1.2 mm・深さ４cmの穿孔３点を施し、その穿孔に爪楊枝に繁殖させたR. quercivoraを接種した。また非接種区（対照区）の穿孔には無菌の爪楊枝のみを接種した。2）サンプリング接種後1、２、３および４週間目に接種部位を含む垂直上向きに18 cmの主軸を採取した。この主軸を３cm毎の６つのセグメント計６つに剪定バサミで分割し、各セグメントの下部数mmを菌の再分離に、残りを抽出成分の定量に用いた。処理区としてはミズナラ・コナラともに接種区と対照区、さらに接種後１週間毎に４週間目までの合計16 処理区を設け、各区につき７本の苗を供試した。3）Raffaelea quercivoraの再分離 各試料を0.5 _%_アンチホルミン溶液で５分間表面殺菌した後滅菌水で３回洗浄し、PDA平板培地に置いた。その後20 ℃の暗室に約１週間静置し観察した。4）材抽出成分の定量各試料を凍結乾燥させ、剪定バサミで数mm角に刻んだ後、ボールミルにより粉砕し、粉末状にした。この試料を50 _%_メタノールで24 時間抽出し、その抽出液からトータルフェノール、縮合型タンニン、エラグタンニンを比色法によりそれぞれ定量した。3. 結果1） Raffaelea quercivoraの再分離 Raffaelea quercivoraの各部位における分離率については、ミズナラ・コナラ両樹種とも接種点で最も高く、接種点から離れるにしたがって減少していた。ミズナラ・コナラ間でR. quercivoraの分離率および分離部位に大きな違いは見られなかった。 Raffaelea quercivora接種区の試料では、ミズナラ・コナラ両樹種ともに対照区より明らかに大きな辺材変色域の形成が認められた。接種区では、ミズナラ・コナラ両樹種とも変色域の形成は接種部位付近に留まっていたが、R. quercivoraは変色域から離れた部位からも分離された。2）材抽出成分の定量ミズナラ・コナラ両樹種とも各抽出成分量が一度ピークに達し、その後減少した。しかし、ピークに達したのはミズナラが接種後３週間目であったのに対し、コナラは接種後２週間目であった（図１）。一方、対照区の各抽出成分はミズナラ・コナラ両樹種ともに、接種後時間が経過しても大きな変動は認められなかった。4.考察材抽出成分の定量実験の結果、材抽出成分量の時間的な変動様式においてはミズナラ・コナラ間で差が見られた。一方、R. quercivoraの再分離試験では両樹種間に差は見られなかった。これらのことから、ナラ枯れ被害の程度は本菌の材内進展の程度によるものではなく、それぞれの樹種が菌の感染に対して引き起こす生理的防御反応の応答速度の違いによるものである可能性が示唆された。

マツ材線虫病の病原体マツノザイセンチュウ (Bursaphelenchus xylophilus) には弱病原性系統と呼ばれるアイソレイト群が存在する。弱病原性アイソレイトは、いずれも宿主マツを発病枯死させる能力が殆どなく、本病の主要な媒介昆虫であるマツノマダラカミキリに殆ど乗り移らないとされている。また、これら弱病原性系統は、強病原性系統とは遺伝的に隔たった姉妹群をなしている。ところが、野外での両系統のすみ分けは実証されておらず、系統間交配も容易であることから、野外では、競争力の弱い弱病原性系統の個体群が一方的に排除されるか、もしくは強病原性系統の個体群内に取り込まれつつあると考えられる。しかし、これまで強弱２系統の混合により生じた集団が野外に存在するか否かは確かめられていない。そこで、弱病原性系統に特異的な分子マーカーを用いて日本産アイソレイト28株の中での弱病原性系統の遺伝的寄与を調査することを目的として本研究に着手した。 マツノザイセンチュウ強病原性アイソレイト S10、弱病原性アイソレイト C14-5 から抽出した DNA を鋳型とし、プライマー対 hsp70f(5ユ-GACACCGAGCGTCTAATCGGAG-3ユ) + hsp70r(5ユ-GTACCACCTCCAAGATCGAAG-3ユ) および制限酵素Alu_I_ を用いて PCR-RFLP 解析を行ったところ、両アイソレイトを区別し得る明瞭な多型パターンが得られた。なお、このPCR 産物であるヒートショックプロテイン 70A （以下、 hsp70 と略す）遺伝子の部分配列から、パターンの差となって現れた塩基の置換はアミノ酸の置換につながるものでなく、したがって本遺伝子の機能には影響していないことが判明した。 次に、PCR-RFLP 画像解析法により hsp70 対立遺伝子の頻度を推定するための検量線を作成した。まず、 S10 - C14-5 の９段階に混合比を調整した混合懸濁液からそれぞれ抽出した DNA を鋳型として PCR-RFLP の多型パターンを得た。S10 特異的なバンドの強度と C14-5 特異的なバンドの強度との比を従属変数、実際の S10 混合比と C14-5 混合比との比の値を説明変数として回帰分析を行ったところ、両者のあいだには線形的な関係が成り立ち、原点を通る傾き１の直線に近似できた。以後、この直線を検量線として遺伝子頻度の推定を行うこととした。 また、選抜したマーカーの中立性を検討するため、S10 - C14-5 の混合集団内におけるマーカー対立遺伝子頻度の経時変化をPCR-RFLP 画像解析法により調査したところ、培養期間が進むにつれS10 型のhsp70 対立遺伝子の頻度は 0.7_から_0.8 に近づいていた。このことは、hsp70 遺伝子に対して見かけ上の頻度依存性選択が働いたことを示している。このため、hsp70 遺伝子は中立マーカーとしては利用できないと考えられた。しかし、一旦集団中に拡がった C14-5 型の対立遺伝子が選択により完全に排除されることはないと確認できたので、C14-5 型の hsp70 対立遺伝子を持たない集団には弱病原性系統が遺伝的に寄与していない可能性が高い、と判定できると結論した。 同じ手法で日本各地産アイソレイト28株について hsp70 遺伝子の対立遺伝子頻度を調査したところ、茨城県笠間市産のアイソレイト Ka1 においてのみ C14-5 型の対立遺伝子が検出された。なお、その推定遺伝子頻度は約 25_%_ であった。残り27系統においてはC14-5 型の対立遺伝子が全く検出されなかったことから、日本産マツノザイセンチュウにおける弱病原性系統の遺伝的寄与はかなり低いと考えられた。 本研究により、少なくともアイソレイト Ka1 の分離された茨城県笠間市にはC14-5 型の対立遺伝子が残されている可能性が明らかになった。今後、弱病原性系統の生物学的な遍歴を明らかにする上で、両系統の遺伝的寄与の大きさを量的に評価するための中立マーカーの開発を進めるとともに、この地域を中心として弱病原性系統由来の対立遺伝子の分布について地域レベルでさらに詳しく調査することが非常に重要であると考える。